Neben den klassischen Einsatzfeldern von Biotests in den Bereichen Chemikalienprüfung und Abwasseruntersuchung wird die Untersuchung von Böden - auch in Rahmen des Bodenschutzgesetzes - zunehmend wichtiger. Hierbei werden auch aquatische Organismen wie Algen, Daphnien und Wasserlinsen, einerseits für die Risikoabschätzung des Wasserpfades andererseits aber auch als empfindliche, gut verfügbare und effektive Detektoren, eingesetzt. Wasserlinsen können in einem breiten pH-Bereich auch auf gefärbten und trüben Eluaten, aber auch auf Feststoffsuspensionen eingesetzt werden. Das macht den Wasserlinsentest wesentlich flexibler als den Algentest. Dies gilt völlig analog auch für die Untersuchung von Sedimenten. Der große Vorteil des Wasserlinsentests gegenüber dem Keimungs- und Wachstumstest mit z. B. Kresse ist das homogene Testmaterial. Alle Wasserlinsenpflanzen sind Klone, während bei Saatgut die Herkunft der Charge, die Samengrößenverteilung als auch die generelle Heterogenität des Erbmaterials zu einer großen Standardabweichung innerhalb der Parallelen beitragen. Vergleiche der Empfindlichkeit verschiedener Biotestsysteme sind generell mit Vorsicht zu betrachten (siehe: Empfindlichkeit von Wasserlinsen - Ein Vergleich, LemnaTec 1999-020). Die vorliegenden Untersuchungen deuten darauf hin, daß keines der Testsysteme Alge, Wasserlinse oder Kresse über alle getesteten Stoffklassen hinweg empfindlicher ist als die anderen. Dies kann man problemlos über die unterschiedliche Herkunft als niedere oder höhere Pflanzen und die Zuordnung zu monokotylen und dicotylen Pflanzen erklären. Generell besteht bisher in Biotestbatterien oft eine Lücke im Bereich schneller Tests mit höheren Pflanzen. Hier bieten Wasserlinsen eine effektive Testmöglichkeit. Eine ganze Reihe von Normen (siehe unten) lassen den Einsatz von Bodeneluaten im Wasserlinsentest zu, jedoch nicht in allen Fällen eignet sich das verwendete Nährmedium auch für Bodeneluate. Gute Erfahrungen liegen hierbei mit dem Steinberg-Medium vor, welches zum DIN-Standardmedium werden soll. Weitere Untersuchungen zum Einsatz des Wasserlinsentests mit Bodeneluaten werden zur Zeit im Rahmen des DBU-Projekts "Ökotoxikologische Testbatterien" am Lehrstuhl für Biologie V der RWTH Aachen mit Unterstützung der LemnaTec GmbH durchgeführt.

Vergleich der Empfindlichkeit von Algen und Wasserlinsen in Biotests

Eine SimulationDie Toxizität eines Stoffes oder Stoffgemisches beruht immer auf der Wechselwirkung der Stoffe mit dem jeweiligen Organismus. Da Organismen sehr unter­schiedlich strukturiert sind, ist es deshalb nur logisch, dass sie mit unterschiedlicher Empfindlichkeit (also vergleichbare Schädigung bei anderen Konzentratio­nen) auf denselben Stoff reagieren.Vergleiche der Empfindlichkeit von Organismen werden immer dann durchge­führt, wenn man das Ziel hat, Stoffe in möglichst niedrigen Konzentrationen zu detektieren, oder z. B. in Biotestbatterien das toxische Potential von Stoffen oder Stoffgemischen auf die Umwelt zu bewerten.
Aus diesen Gründen gibt es auch für Algen und Wasserlinsen eine große Zahl von vergleichenden Studien (siehe Literaturangaben unten).EC-Werte für annähernd exponentiell wirkende Systeme, die auf der Basis von Biomasseintegral oder Biomassezuwachs berechnet werden, sind jedoch (im Gegensatz zu Werten auf der Basis von Wachstumsraten) abhängig von der Testdauer und der Wachstumsrate der Kontrolle (Nyholm 1985, Nusch1982). Abbildungen 1 und 2 zeigen diese Abhängigkeit der Hemmung für den EC₂₀- und den EC₅₀-Wert jeweils für den Bereich von Wasserlinsentests (µ = 0,275; 0,325; 0,375) und für Algentests (µ = 0,9; 1,4; 1,9). Dies bedeutet, dass die so ermit­telten Ergebnisse und Empfindlichkeiten abhängig vom Testdesign sind. Schon an diesen Grafiken zeigt sich der erhebliche Einfluss von Testdauer und Wachs­tumsrate auf die Hemmung.

Abb. 1: Einfluss der absoluten Wachstumsrate der Kontrolle und der Testdauer  auf die Hemmung des Biomassezuwachses bei einer konstanten Hemmung der Wachstumsrate von 20 %.

Abb. 2: Einfluß der absoluten Wachstumsrate der Kontrolle und der Testdauer  auf die Hemmung des Biomassezuwachses bei einer konstanten Hemmung der Wachstumsrate von 50 %.

Um einen quantitativen Eindruck diese Phänomens und seiner Auswirkung auf die Bewertung von Vergleichsstudien zu bekommen, wurden einige Vergleichs­szenarien ausgewählt und numerisch Hemmwerte simuliert. Ziel war die Beant­wortung der Frage, wie weit sich die Vergleichsergebnisse auf der Basis des im Einzeltest sensibleren Biomassezuwachses von den Werten der ökologisch rele­vanten, aber in Einzeltests weniger sensiblen Wachstumsrate, unterscheiden.Drei Vergleichsszenarien wurden aus der Literatur ausgewählt. Wasserlinsen- und Algentest mit jeweils 4 Tagen Dauer (Modell W4A4, Fairchild et al. 1997), ein 7 Tage Wasserlinsentest gegen einen eintägigen Algentest (Modell W7A1, Grossmann et al. 1992) und Tests nach OECD-Normen, Alge (3 Tage) gegen Wasser­linse (7 Tage)(Modell W7A3). In allen Fällen wurde nach Biomassezuwachs aus­gewertet, wobei Biomasseintegrale generell zu sehr ähnlichen Ergebnissen geführt hätten (Nyholm 1985).Abbildung 3 stellt die Abhängigkeit der Hemmung von der Wachstumsrate der Kontrolle für beide Tests mit jeweils 4 Tagen Dauer dar (Modell W4A4)). Die Hemmung des Biomassezuwachses verändert sich besonders für Algen im Be­reich der in der Praxis vorkommenden Wachstumsraten sehr erheblich. So kann eine Hemmung der Wachstumsrate von 20 % zu einer Hemmung des Biomassezuwachses für Algen zwischen 57 (µ = 1,0 d^-1) und 77 % (µ = 1,8^-1) führen. Beim Vergleich beider Organismen bei mittlerer Wachstumsrate unterscheiden sich die Hemmwerte um 35 % für den EC₂₀- und 30 % für den EC₅₀-Wert. Dies führt bei steilen Konzentrations-Wirkungsbeziehungen EC-Werten (Biomasse­zuwachs) für Wasserlinsen, die um Fakor 2 höher sind als die der Algen bei glei­cher Hemmung der Wachstumsrate. Bei flachen Konzentrations-Wirkungsbezie­hungen kann sogar bis Faktor 7 der EC-Konzentrationen zwischen Wasserlinsen und Algen liegen, obwohl über die Wachstumsrate der gleiche EC-Wert ermittelt worden wäre.

Abb. 3: Abhängigkeit der Hemmung des Biomassezuwachses von der Wachstumsrate der Kon­trollen für Wasserlinsen (links) und Algen (rechts) für das Modell W4A4 (Wasserlinsentest 4 Tage, Algen 4 Tage)

Schon die wenigen Beispiele demonstrieren, dass nur auf der Basis von Wachstumsraten  wissenschaftlich fundierte Vergleiche von Empfindlichkeiten verschiedener Organismen möglich sind. Studien auf der Basis von Biomasseintegralen oder Biomassezuwachs sind dagegen völlig wertlos, wenn nicht zumin­dest die jeweilige Wachstumsrate der Kontrollansätze und die Steilheit der Kon­zentrations-Wirkungsbeziehung mit angegeben werden. Am Beispiel des Algentests wird aber auch deutlich, dass schon bei einer Art aber verschiedenen, von den Normen zugelassenen, Wachstumsraten die dadurch bedingten scheinbaren Sensibilitätsunterschiede sehr groß werden können. Damit führt dieses Szenario von seiner Struktur her dazu, Toxizitäten gegenüber Algen weit höher zu bewer­ten als solche gegenüber Wasserlinsen. Bei Tests mit 16 Herbiziden und Lemna minor und Selenastrum war dennoch nach der Berechnung des Biomassezuwachses die Wasserlinse bei 8 Stoffen „empfindlicher“. Ein direkter Empfindlichkeitsvergleich über den Biomassezuwachs zwischen Lemna (4 Tage), verschiedenen Algen (4 Tage) und wurzelnden submerse Ma­krophyten einschließlich eines Rankings für 4 ist deshalb nicht angemessen (Fairchild et al. 1997). Werden dagegen Tests nach dem Szenario W7A1 auf Biomassezuwachsbasis verglichen, schneiden Wasserlinsen tendenziell 2 – 10 % „empfindlicher“ ab als Algen (Abbildung 4). Dies zeigen auch die Studienergebnisse, bei denen die Wasserlinse bei 8 Pestiziden immer gleich empfindlich oder empfindlicher war als die Algen (Grossmann et al.1992). Das Ergebnis wird also auch hier durch das Testdesign schon fast erzwungen.

Abb. 4: Abhängigkeit der Hemmung des Biomassezuwachses von der Wachstumsrate der Kon­trollen für Wasserlinsen (links) und Algen (rechts) für das Modell W7A1 (Wasserlinsentest 7 Tage, Algen 1 Tag)  

Werden der 7 Tage-Wasserlinsentest und der 3 Tage-Algentest zu Vergleichszwecken herangezogen, reagiert der Test durch das Testdesign für Algen bei mittleren Wachstumsraten um etwa 10 – 15 % empfindlicher als für Wasserlinsen (Abbildung 5).

Abb. 5: Abhängigkeit der Hemmung des Biomassezuwachses von der Wachstumsrate der Kon­trollen für Wasserlinsen (links) und Algen (rechts) für das Modell W7A3(Wasserlinsentest 7 Tage, Algen 3 Tage).

Je nach Wachstumsrate kann die Hemmung des Biomassezuwachs innerhalb ei­nes Systems um bis zu 18 % unterschiedlich sein - bei konstanter Hemmung der Wachstumsrate. Je nach Steilheit der Konzentrations-Wirkungsbeziehung können eine 18 % höhere Hemmung im Algentest die Konzentration des betreffenden EC-Wertes zwischen Faktor 1,5 (steile Konzentrations-Wirkungsbeziehung, wie z. B. 3,5-DCP) und Faktor 4 (flache Konzentrations-Wirkungsbeziehung, wie bei Kaliumdichromat) gegenüber dem EC-Wert des Biomassezuwachses für Wasser­linsen erniedrigen. 
Zukünftige Normungsvorhaben und Vergleichsstudien sollten diese Zusammenhänge berücksichtigen. Dies bedeutet, dass im Falle der Berechnung von Bio­masseintegral und Biomassezuwachs für den Vergleich zwischen Organismen, die erlaubten Wachstumsraten, besonders im Algentest, stärker als bisher be­grenzt werden sollten. Vergleiche zwischen Organismen auf der Basis von EC-Werten aus Biomasseintegral oder Biomassezuwachs sind grundsätzlich auszu­schließen, da es keine einheitliche Vergleichsbasis gibt. Dies zeigt auch Abbildung 6 a, b mit der Zusammenfassung der EC₂₀- und EC₅₀-Werte für verschiedene Testszenarien und Wachstumsraten deutlich.

Abb. 6: Abhängigkeit der Hemmung des Biomassezuwachses für eine Hemmung der Wachstums­rate von 20 % (links) und 50 % (rechts) von der Wachstumsrate der Kontrollen für Wasserlinsen (in Graphik links) und Algen (in Graphik rechts)

Werden dagegen Wachstumsraten als Basisgröße ermittelt, treten weder Vergleichsprobleme zwischen Tests mit einem Organismus noch mit mehreren Organismen auf. Dafür liegen jedoch die EC-Werte für exponentiell wachsende Systeme aus mathematischen Gründen höher als die entsprechenden Werte auf Basis von Biomassezuwachs oder Biomasseintegral.Bis es einen breiten Konsens über die angemessene Art der Auswertung gibt, sollten deshalb wissenschaftliche Ergebnisse und Testresultate so dokumentiert oder veröffentlicht werden, dass entweder sofort alle Auswertungsverfahren angewendet werden oder die Rohdaten für eine nachträgliche Bewertung einfach zugänglich sind.

Wasserlinsen als Biosensoren

Im Biotestsektor zu Erfassungen von Wirkungen auf die Umwelt gibt häufig eine Trennung zwischen Tests mit ökologisch relevanten Systemen, die sehr aussagekräftig sind, aber häufig erhebliche Zeit benötigen (Wasserlinsentest 7 Tage, Algentest 3 Tage, Daphnientest 2 / 21 Tage, Collembolentest 21 Tage, Pflanzenaufwuchstests 21-28 Tage ...) und Tests wie z. B. dem Leuchtbakterientest oder Algenfluoreszenztest. Hier wird ein marines Bakterium eingesetzt und dessen Luminiszenzveränderung innerhalb von 30 min oder 24 h gemessen bzw. bei den Algen die Abklingkurve der Fluoreszenz erfasst.
Generell sehr mager ist die Bilanz bei Biotests mit höheren Pflanzen, die bisher in der Chemikalienzulassung, dem Wirkstoffscreening und der Bewertung von Böden und Abwässern stark vernachlässigt wurden. Dies ist ein echtes Problem, da schon von Algen bekannt ist, dass sie bei der Chemikalienzulassung meist die Grenzwerte oder Nutzungsbeschränkungen auslösen. Auch wenn bisher nur wenige Vergleichsstudien von Wasserlinsen und Algen auf der Basis de Wachstumsrate vorliegen (siehe LemnaTec "Vergleich der Empfindlichkeit von Algen und Wasserlinsen") so zeichnet sich generell der Trend ab bzw. ist es auch physiologisch für eine höhere Pflanze, dass Wasserlinsen für viele Schadstoffe empfindlicher sind als einzellige Algen.
Wenn es also die Möglichkeit gäbe, Wasserlinsen als schnell reagierende Biosensoren auch in Online-Testbatterien bzw. in schnellen Screeningtests einzusetzen, wäre dies ein wichtiger Durchbruch zur Schließung der Lücke des Bereichs "Wirkung auf höhere Pflanzen". Der Einsatz der gleichen Kultivierungs- und Auswertungseinheiten wie beim normierten Wasserlinsen-Wachstumstest erleichtert dabei die Testeinführung massiv. Die technische Einsatzfähigkeit des Detektorsystems liegt bei LemnaTec vor, da hier Größen, Färbungen, räumliche Verleilungen von farben und Formen bei sichtbarem licht, aber auch bei verschiedensten Anregungs- und Detektionswellenlängen gemessen, bzw auch Luminiszenz quantitativ dargestellt werden kann.
Außerdem kann die Wasserlinse auch sehr problemlos in gefärbten und trüben Proben eingesetzt werden, was sie massiv gegenüber Leuchtbakterien und Algen bevorteilt. Die Wasserlinse reichert auch Substanzen aus dem Wasser an, was die Empfindlichkeit weiter steigert.
Durch die gentechnische Veränderung besteht ausserdem erstmals die Möglichkeit eine sehr gut handhabbare und eingeführte Pflanze als Indikator für eine Vielzahl spezifischer Anwendungen einzusetzen. Zu denken ist hier an chemisch schwer handhabbare Schadstoffklassen bzw. Stoffen die in spezifische Rezeptortaschen passen bis hin zu den endokrin wirksamen Substanzen, und viralen Infektionen. Da keine Keimung erfolgt, Klone eingesetzt werden und immer sehr homogenes Inokulum zur Verfügung steht, welches direkt auf einer wässerigen Lösung eingesetzt werden kann, verspricht dieses übersichtliche Testsystem eine hohe Reproduzierbarkeit und minimale unerwünschte Wechselwirkungen mit der Testumgebung (z B. Matrix zur Keimung bei Arabidopsis). Aber auch an das Großscreening in der spezifischen Wirkstoffsuche in der chemischen und biotechnologischen Industrie kann hier massiv profitieren. Dort werden mittlerweile pro Jahr hunderttausende Substanzen gescreent und je mehr spezifische Information verfügbar wird desto besser. Dort ist die Wasserlinse sehr gut bekannt. Auch hier hat die trägerfreie Verwendung einer höheren Pflanze in wässeriger Lösung nur Vorteile.